分辨顯微成像技術自誕生以來，憑借其優(yōu)異的納米級空間分辨率，已成為生命科學研究中*揭示復雜生命現(xiàn)象的重要成像技術。

其中，基于單分子定位的分辨成像策略，使得定位、觀察、研究單個探針分子的理、化、光學性能成為可能。偏振作為熒光信號的一個重要特性，近年來伴隨著單分子三維取向成像技術的發(fā)展，逐步在單分子成像和分辨領域中展示出諸多新穎且重要的應用特性。

*納米科學中心科學納米生物效應與安全性重點實驗室的趙睿航，盧晉團隊結(jié)了單分子三維取向分辨成像技術的*進展，介紹并分析了兩類主要的單分子三維取向熒光顯微技術——基于熒光吸收與輻射偏振調(diào)制的單分子三維取向成像方法以及利用點擴散函數(shù)工程將單個熒光分子的三維取向信息編碼到熒光圖像上的成像策略。

分辨熒光成像技術概述

分辨熒光成像技術主要分為三類。基于單分子定位的分辨顯微（SMLM）技術分辨率高，但成像時間長、時間分辨率差；結(jié)構(gòu)光照明顯微成像（SIM）技術成像速度快、光子利用率高、適用染料多，但分辨率有限；受激輻射損耗（STED）分辨顯微技術可提升分辨率，但存在光毒性和光漂白問題。此外，還有*低光子通量（MINFLUX）分辨成像策略，具有較高定位精度和成像分辨率。

在生物研究中，生物大分子的微觀結(jié)構(gòu)和分子間相互作用變化在取向角度域有顯著變化，單分子三維取向分辨成像技術有助于深入闡釋生命過程機制。

單分子三維取向成像技術

一、基于熒光吸收與輻射偏振調(diào)制的方法

1、技術原理

利用熒光分子吸收與輻射過程中偏振特性，通過在激發(fā)光路加入偏振調(diào)制模塊，分析不同偏振方向激發(fā)光吸收效率及熒光發(fā)射信號偏振方向，獲取單分子三維取向信息。如單分子熒光偏振（SMFP）技術，交替用平行和垂直偏振光激發(fā)樣品，經(jīng)偏振分光棱鏡分路接收熒光信號，分析強度擬合取向和動力學信息。

SMFP技術成像示意圖

2、研究案例

對肌動蛋白和S-DNA構(gòu)象研究，通過熒光偏振顯微技術測量取向變化，確定分子取向信息。

3、技術局限

線偏振激發(fā)調(diào)制要求單分子常亮且取向固定，與SMLM結(jié)合時需篩選常亮單分子，效率受限；僅對發(fā)射信號偏振分光成像雖便捷但難同時獲取多未知參數(shù)，適用于有取向分布先驗信息的樣品。

二、基于PSF工程的方法

1、單分子三維取向?qū)MILM定位精度的影響及校正

單分子三維取向會使定位結(jié)果產(chǎn)生偏差，可通過設計“y-phi”掩模等方法消減偏差光子提升定位精度。

單分子三維取向?qū)Χㄎ痪鹊挠绊懪c校正

2、高焦成像策略

離焦成像可展示單分子取向差異，但會增加PSF尺寸、降低信噪比和定位準確性；利用*似然估計從單分子PSF圖樣獲取取向信息，但對軸向分量不敏感。

3、傅里葉面調(diào)制策略

• CHIDO方法：使用雙折射掩模編碼PSF，通過應力工程光學器件產(chǎn)生雙折射圖案，經(jīng)四分波片和沃拉斯頓棱鏡分離成右旋圓（RHC）和左旋圓（LHC）PSF，可攜帶定位取向信息，對單分子三維取向和位置檢測能力強。

單分子三維取向及CHIDO技術示意圖

• Vortex PSF技術：在共軛后焦平面加入渦旋相位板獲得 Vortex PSF，可確定分子三維位置、取向和擺動信息，精度高、信噪比高，形狀對極角和方位角敏感，可用于解析熒光探針與樣品相互作用。

Vortex PSF成像示意圖

4、基于傅里葉面調(diào)制的單分子顯微成像系統(tǒng)性策略

以傅里葉光學為理論框架，將偶極子信息編碼到單分子熒光圖像，如SMOLM技術可實現(xiàn)單分子三維取向與定位同時成像；后續(xù)研究不斷發(fā)展該技術，如利用NR對磷脂膜成像揭示其對化學成分響應，將Vortex PSF應用于SMOLM對雙層脂膜成像剖析生物樣品結(jié)構(gòu)特征，提出raPol顯微鏡及raMVR顯微鏡提高檢測率和精度，實現(xiàn)對多種生物樣品的成像研究。

利用SMOLM技術對磷脂膜微區(qū)分辨成像

基于偏振渦旋PSF的SMOLM成像原理圖

raPol顯微鏡

raMVR顯微鏡

應用于活細胞或單顆粒的分辨取向成像技術

1、分辨偶極取向映射（SDOM）方法

通過調(diào)制偏振激發(fā)光解析熒光偶極子取向，亞衍射極限分辨率，成像速度快，適用于活細胞成像。

2、偏振SIM（pSIM）技術

結(jié)合熒光偏振調(diào)制和結(jié)構(gòu)光照明技術，可解析生物分子取向與結(jié)構(gòu)信息，與三維SIM結(jié)合實現(xiàn)快速偏振三維SIM（polar-3DSIM）成像。

3、光譜和偏振光學層析成像（SPOT）技術

從熒光強度、光譜和偏振三個維度解析膜信息，用于活細胞亞細胞尺度脂質(zhì)組學研究，可實時監(jiān)測細胞活動。

4、單分子熒光偏振顯微鏡在單顆粒催化成像中的應用

用于納米限域效應的單分子三維取向研究，解釋了納米催化劑上的催化活性現(xiàn)象。

結(jié)與展望

單分子三維取向成像技術在解析生物樣品納米尺度結(jié)構(gòu)與有序度、生物大分子構(gòu)象等方面具備優(yōu)勢，但其廣泛應用面臨諸多挑戰(zhàn)。

在熒光標記策略上，現(xiàn)有方式難以確保熒光探針與生物大分子取向關系，如基于不同原理的 SMOLM 技術均存在各自問題；在單分子熒光亮度或成像信噪比方面，成像策略會降低信噪比，但已有優(yōu)化篩選熒光探針提升信噪比的嘗試；活細胞成像受多種因素影響困難重重，雖可借鑒相關方案且深度學提供新思路，但復雜微環(huán)境仍增加了解析難度；多色成像或波長維度拓展是應用于復雜生命過程研究的趨勢。

不過，隨著技術發(fā)展，該技術在提升成像*度、推進應用廣度和深度等方面前景依然廣闊。

聲明：本文僅用作學術目的。文章來源于：趙睿航, 盧晉. 單分子三維取向分辨成像技術進展（特邀）[J]. 激光與光電子學進展, 2024, 61(6): 0618015. Ruihang Zhao, Jin Lu. Three-Dimensional Orientation and Localization Microscopy of Single Molecules Using Super-Resolution Imaging Technology (Invited)[J]. Laser & Optoelectronics Progress, 2024, 61(6): 0618015.