由于衍射極限的存在，傳統(tǒng)的光學(xué)成像手段無法觀測(cè)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)及細(xì)胞器之間的相互作用。單分子定位顯微成像技術(shù)作為三種分辨技術(shù)中分辨率*的成像技術(shù)，為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究提供了重要手段。

大視場(chǎng)高通量單分子成像技術(shù)具有分辨率高、成像范圍大和成像時(shí)間短等特點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛用于觀察和分析復(fù)雜的生物結(jié)構(gòu)和功能。

南方科技大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系的林昭珺團(tuán)隊(duì)發(fā)表文章，從基于硬件掃描的拼接成像技術(shù)、基于大面陣sCMOS的大視場(chǎng)高通量成像技術(shù)、大景深單分子定位成像技術(shù)、高通量數(shù)據(jù)分析技術(shù)4個(gè)方面回顧近年來大視場(chǎng)高通量單分子定位技術(shù)的研究進(jìn)展。*，對(duì)大視場(chǎng)高通量單分子定位成像技術(shù)的發(fā)展方向進(jìn)行展望。

研究背景

一、傳統(tǒng)成像技術(shù)的局限與分辨顯微成像技術(shù)的興起

傳統(tǒng)光學(xué)成像受衍射極限限制，橫向分辨率約250nm，軸向分辨率約500nm，難以觀測(cè)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)及相互作用。電子顯微鏡雖分辨率高，但存在制樣復(fù)雜、缺乏分子特異性和無法多色成像等問題，無法用于活細(xì)胞成像。

分辨顯微成像技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，主要包括結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)（SIM）、受激發(fā)射損耗顯微成像技術(shù)（STED）和單分子定位成像技術(shù)（SMLM），其中SMLM分辨率*，橫向可達(dá) 20-30nm，軸向可達(dá)60nm。

二、單分子定位技術(shù)原理及應(yīng)用

單分子定位技術(shù)通過讓視場(chǎng)范圍內(nèi)熒光分子隨機(jī)稀疏激活發(fā)光，利用定位算法擬合單分子點(diǎn)空間位置，多次循環(huán)采集完成定位，實(shí)現(xiàn)分辨成像。

該技術(shù)廣泛應(yīng)用于觀測(cè)細(xì)胞骨架、膜蛋白分布和細(xì)胞器相互作用等，但傳統(tǒng)方法需采集大量原始數(shù)據(jù)，成像時(shí)間長(zhǎng)、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和分析壓力大。

三、高通量成像的重要性及需求

高通量成像在觀察細(xì)胞形態(tài)、篩選和分析大量細(xì)胞表型等方面優(yōu)勢(shì)顯著，可在單次采集中獲取更多成像數(shù)據(jù)。

隨著單分子定位技術(shù)應(yīng)用增多，對(duì)其視場(chǎng)大小和吞吐量要求提高，高通量分辨成像有助于探究不同細(xì)胞種群差異，對(duì)跨尺度成像意義重大。

基于硬件掃描的拼接成像

一、技術(shù)實(shí)現(xiàn)方式及案例

Holden等改進(jìn)硬件和軟件構(gòu)建高通量PALM，將10/90分束鏡用于定制顯微鏡，90%光用于3D-PALM，采用自動(dòng)閉環(huán)控制熒光團(tuán)密度機(jī)制，利用805nm激光反射光自動(dòng)鎖焦，對(duì)數(shù)百個(gè)活新月桿菌FtzS進(jìn)行三維成像并定量分析Z-ring納米級(jí)結(jié)構(gòu)。

高穩(wěn)定顯微鏡

Mund等設(shè)計(jì)的顯微鏡在樣品上劃分區(qū)域，預(yù)定義激光強(qiáng)度等參數(shù)自動(dòng)采集，平臺(tái)移動(dòng)后有機(jī)械平衡時(shí)間，引入近紅外激光和象限光電二極管實(shí)現(xiàn)z方向鎖焦，研究?jī)?nèi)吞過程中內(nèi)吞蛋白組織結(jié)構(gòu)。

Beghin等提出的全自動(dòng)化顯微鏡平臺(tái)集成多種模塊，低倍鏡篩選后高倍鏡分辨成像，自動(dòng)鎖焦減少漂移，對(duì)96孔樣品板微管成像，三維定位和圖像重建耗時(shí)8h，平均每孔5min。

二、自動(dòng)聚焦技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展

單分子定位技術(shù)長(zhǎng)時(shí)間成像易受溫度等因素導(dǎo)致圖像漂移，自動(dòng)聚焦技術(shù)至關(guān)重要。傳統(tǒng)自動(dòng)聚焦技術(shù)分兩類，近期深度學(xué)也用于此，如Pinkard等根據(jù)散斑信號(hào)利用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)量化離焦量，Lightley等引入額外激光和相機(jī)，通過深度學(xué)分析反射光斑圖像實(shí)現(xiàn)自動(dòng)聚焦，訓(xùn)練好的模型應(yīng)用于顯微成像系統(tǒng)可快速自動(dòng)對(duì)焦。

自動(dòng)對(duì)焦的easySTORM

三、存在的問題

基于硬件掃描的拼接成像受位移臺(tái)精度和拼接算法影響大，對(duì)位移臺(tái)和圖像配準(zhǔn)精度要求嚴(yán)苛，否則會(huì)產(chǎn)生偽影影響成像質(zhì)量。

相鄰子區(qū)域多次受激光照射，增加光毒性且熒光易漂白；圖像拼接時(shí)相鄰圖像可能不連續(xù)；需定制硬件設(shè)施和額外鎖焦系統(tǒng)，操作復(fù)雜、成本高；成像時(shí)間久。

基于大面陣相機(jī)的非拼接式成像

一、技術(shù)優(yōu)勢(shì)與面臨的挑戰(zhàn)

傳統(tǒng)單分子定位顯微系統(tǒng)中，傳感器面積和傳感單元數(shù)量限制了分辨能力和視場(chǎng)大小，二者相互制約。大面陣sCMOS傳感器的出現(xiàn)使兼顧兩者成為可能，但面臨大視場(chǎng)均勻照明和像差校正等挑戰(zhàn)。

二、實(shí)現(xiàn)均勻照明的多種方法

1、光束整形

Douglass等利用微透鏡陣列將高斯光束整形為平頂光束，擴(kuò)大照明面積約4倍，受機(jī)械振動(dòng)影響小、成本低，但場(chǎng)適應(yīng)性有限；還有基于pi-shaper、top-shape等元件的光束整形方法。

2、多模光纖

Zhao等利用激光光束組合器和多模光纖實(shí)現(xiàn)大視場(chǎng)均勻照明，保證照明功率密度；Deschamps等將多模激發(fā)與TIRF技術(shù)結(jié)合，獲得均勻熒光亮度和光學(xué)切片效果。

基于多模光纖的大視場(chǎng)均勻照明方案的光路

3、波導(dǎo)技術(shù)

Diekmann等提出的Waveguide-TIRF技術(shù)利用波導(dǎo)產(chǎn)生均勻TIRF照明，降低背景噪聲、提高信噪比和分辨率，但存在照明區(qū)域難限制、會(huì)同時(shí)照明和漂白整個(gè)樣品、波導(dǎo)制備與系統(tǒng)復(fù)雜等問題。

Waveguide-TIRF技術(shù)原理

4、掃描振鏡

Mau等利用振鏡掃描高斯光束實(shí)現(xiàn)約200μm×200μm視場(chǎng)均勻照明，需保證掃描與曝光高度同步，增加系統(tǒng)復(fù)雜度。

5、棱鏡式照明

Foylan等提出的MesoTIRF照明方案利用棱鏡和發(fā)物鏡實(shí)現(xiàn)大視場(chǎng)TIRF照明；Rames等利用4π籠式透鏡實(shí)現(xiàn)TIRF與Hilo兩種照明模式切換，提供較高軸向分辨率。

兩種基于棱鏡的大視場(chǎng)照明方案

大景深單分子定位技術(shù)

一、技術(shù)難點(diǎn)及解決思路

傳統(tǒng)高斯點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)在焦平面前后光場(chǎng)分布對(duì)稱，景深和軸向光場(chǎng)變化幅度小，無法判斷單分子點(diǎn)位置，一次成像只能拍攝焦面附近單分子點(diǎn)。為克服此問題，研究者提出點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)工程、遠(yuǎn)聚焦等技術(shù)路線。

二、點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)工程的具體方法及應(yīng)用

1、散光點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)

莊小威課題組首次將散光像差引入STORM系統(tǒng)，通過插入柱面鏡調(diào)制，實(shí)現(xiàn)±600nm范圍內(nèi)三維定位，軸向分辨率約50nm，因便捷性廣泛應(yīng)用。

不同點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)示意圖與景深對(duì)比

2、雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)

Moerner課題組利用相位板實(shí)現(xiàn)，其形狀隨焦深變化，景深約±900nm，定位精度對(duì)軸向位置敏感度低，實(shí)現(xiàn)10-20nm軸向分辨率和約2μm景深三維成像。

6μ μm-Tetrapod與20μ μm-Tetrapod及其相位示意圖

3、自彎曲點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)

莊小威課題組利用艾里光束設(shè)計(jì)，通過其不同焦深橫向位置定位熒光分子，實(shí)現(xiàn)3μm成像范圍內(nèi)10-15nm三維定位，但使用空間光調(diào)制器會(huì)降低信噪比。

4、Tetrapod點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)

Moerner課題組基于相位板調(diào)制出一系列，擁有*景深可達(dá)20μm，定位精度較高，在多色成像、活細(xì)胞成像等方面有應(yīng)用，如對(duì)活芽酵母細(xì)胞染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行三維追蹤成像；2022年Fu等利用可變形鏡優(yōu)化，提升定位精度。

三、遠(yuǎn)聚焦技術(shù)的原理及實(shí)例

遠(yuǎn)聚焦成像系統(tǒng)中，前兩個(gè)物鏡將焦平面附近光場(chǎng)“投影”在第三個(gè)物鏡焦點(diǎn)處，通過移動(dòng)第三個(gè)物鏡改變焦平面位置實(shí)現(xiàn)大景深成像。如Booth課題組利用可變形鏡實(shí)現(xiàn)多平面成像，Radenovic課題組將其與像差校正點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)工程結(jié)合優(yōu)化后對(duì)COS-7細(xì)胞成像，Mondal課題組利用電動(dòng)可調(diào)焦透鏡特性實(shí)現(xiàn)約4.5μm軸向范圍成像。

基于可變形鏡或ETL的遠(yuǎn)聚焦技術(shù)原理

高通量數(shù)據(jù)分析

一、數(shù)據(jù)處理壓力與加速策略

sCMOS數(shù)據(jù)采集通量高，但帶來海量數(shù)據(jù)處理壓力。常用高性能GPU加速計(jì)算集群等方法，如Hu等利用Amazon EC2加速3B分析，Li等提出QC-STORM方法提高處理速度，Gui等提出HCP-STORM異構(gòu)計(jì)算平臺(tái)，速度大幅提升。

分辨定位顯微鏡處理原始圖像的異構(gòu)平臺(tái)

二、圖像拼接的創(chuàng)新方法及優(yōu)勢(shì)

傳統(tǒng)拼接方法基于灰度圖，Du等提出用定位表代替灰度圖的NanoStitcher方法，經(jīng)確定重疊區(qū)域、預(yù)處理、拼接、優(yōu)化路徑、融合平滑等步驟，處理后的微管圖像結(jié)構(gòu)清晰連續(xù)，在*小化文件大小和存儲(chǔ)無損文件方面有優(yōu)勢(shì)。

全景分辨圖像計(jì)算框架

三、其他相關(guān)方法及成果

Barentine等提出采集和分析一體化的高通量納米顯微鏡，配有自動(dòng)鎖焦等機(jī)制，開發(fā)壓縮算法和優(yōu)化代碼，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定位，成像數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞只需*。本課題組提出FD-DeepLoc方法，基于深度學(xué)校正大視場(chǎng)像差，實(shí)現(xiàn)大視場(chǎng)全細(xì)胞分辨成像，提升三維SMLM成像通量約100倍。

高通量單分子定位顯微鏡

FD-DeepLoc示意圖

結(jié)與展望

在工程應(yīng)用方面，目前常將多種高通量單分子成像方法相結(jié)合，例如大面陣sCMOS成像技術(shù)與點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)工程以及高通量數(shù)據(jù)分析技術(shù)相互配合，以此獲得更*的成像效果。

展望未來，為進(jìn)一步提高單分子定位成像通量，可從多個(gè)方向進(jìn)行優(yōu)化。在激發(fā)照明上，可把高功率激光與激發(fā)光掃描技術(shù)相結(jié)合，并采用快速閃爍染料；成像光路方面，調(diào)制系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)以獲取適合大視場(chǎng)低采樣率的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)來提升定位精度；數(shù)據(jù)處理時(shí)，利用深度學(xué)矯正更大視場(chǎng)范圍的場(chǎng)相關(guān)像差；系統(tǒng)設(shè)計(jì)層面，通過高密度成像配合基于深度學(xué)的數(shù)據(jù)分析減少成像所需幀數(shù)，從而提高成像速度及通量。

之，該技術(shù)在成像系統(tǒng)多方面的優(yōu)化中極具研究?jī)r(jià)值與應(yīng)用潛力。

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來源于：林昭珺, 常桓梽, 李依明. 高通量單分子定位顯微成像技術(shù)進(jìn)展（特邀）[J]. 激光與光電子學(xué)進(jìn)展, 2024, 61(6): 0618004. Zhaojun Lin, Huanzhi Chang, Yiming Li. Advances in High-Throughput Single-Molecule Localization Microscopy (Invited)[J]. Laser & Optoelectronics Progress, 2024, 61(6): 0618004.