光片熒光顯微成像技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用

近幾十年來，光片熒光顯微鏡作為熒光顯微技術(shù)的一種革新，顯著提升了生命科學(xué)研究中對(duì)組織與細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的高時(shí)空分辨率成像能力。

相較于傳統(tǒng)的落射熒光顯微技術(shù)，光片顯微鏡通過選擇性逐層照明生物樣本，大大提高了光子利用效率，降低了光毒性，并顯著提升了成像速度。光片顯微鏡問世以來，其在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用范圍逐漸拓寬，從胚胎學(xué)、神經(jīng)科學(xué)到腫瘤研究等多個(gè)領(lǐng)域均有所涉及，不僅可用于觀察細(xì)胞和組織的基本結(jié)構(gòu)，還可用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生物過程中的動(dòng)態(tài)變化。同時(shí)，其跨尺度的特點(diǎn)使其適用于從宏觀到微觀的多個(gè)尺度上的觀察。

華中科技大學(xué)周瑤、費(fèi)鵬團(tuán)隊(duì)發(fā)表文章綜述了光片顯微鏡在高通量成像、分辨成像以及易用性方面的應(yīng)用及發(fā)展，旨在為生命科學(xué)研究人員提供全面的了解和參考，推動(dòng)光片顯微鏡在更多領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展。

光片顯微鏡在高通量成像中的應(yīng)用及發(fā)展

一、面臨的挑戰(zhàn)

在腦科學(xué)研究和腫瘤病理學(xué)診斷中，對(duì)大樣本進(jìn)行三維顯微成像至關(guān)重要，但傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡通量有限，處理大型樣本時(shí)圖像采集時(shí)間長(zhǎng)，且提升分辨率會(huì)降低信噪比。光片顯微鏡雖有優(yōu)勢(shì)，但高斯光片顯微鏡存在視野與光片厚度的矛盾，難以平衡大視野照明探測(cè)和微米級(jí)三維分辨率。

二、技術(shù)改進(jìn)與發(fā)展

1、軸向掃描技術(shù)

2015年，Dean等提出使用音圈電機(jī)、電動(dòng)可調(diào)諧透鏡等電動(dòng)部件沿傳播方向掃描高斯光片，配合科研級(jí)CMOS相機(jī)電子卷簾狹縫掃描，擴(kuò)大了瑞利范圍，提高了成像通量，但對(duì)激發(fā)光功率要求高且會(huì)造成額外光漂白。以mesoSPIM和ctASLM為代表，將此項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于大組織成像取得了*成果。

2、平鋪拼接光片技術(shù)

2015年，Gao等開發(fā)了平鋪拼接光片熒光顯微技術(shù)，利用鐵電液晶空間光調(diào)制器控制光片移動(dòng)，拍攝小視場(chǎng)高分辨圖像后拼接，實(shí)現(xiàn)大視場(chǎng)高軸向分辨率成像，但同步掃描方式存在光漂白等問題。

3、貝塞爾光片技術(shù)

貝塞爾光片是實(shí)現(xiàn)大樣本三維高通量成像的利器，其具有較強(qiáng)自愈性和抗散射能力，干涉可用范圍優(yōu)于高斯光片。2010年，F(xiàn)ahrbach等提出將無衍射的貝塞爾光束與光片技術(shù)結(jié)合的思想，發(fā)明了自愈光束顯微技術(shù)，但貝塞爾光片旁瓣影響軸向分辨率?？茖W(xué)西安光學(xué)精密機(jī)械研究所姚保利研究員團(tuán)隊(duì)和華中科技大學(xué)費(fèi)鵬教授團(tuán)隊(duì)分別采用不同方法抑制旁瓣，實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠大腦的高通量三維成像。2020年，Zhao等將深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與光片顯微鏡結(jié)合提升了分辨率，2021年，F(xiàn)ang等將掃描貝塞爾光片顯微鏡與內(nèi)容感知壓縮傳感計(jì)算方法結(jié)合，大幅提升了分辨率和光學(xué)通量。

光片顯微鏡在高通量成像中的發(fā)展

光片顯微鏡在分辨成像中的應(yīng)用及發(fā)展

一、分辨技術(shù)原理及局限

光學(xué)顯微鏡受衍射極限限制，分辨顯微成像技術(shù)雖提高了空間分辨率，但在時(shí)間分辨率及光毒性方面存在問題，限制了對(duì)生物結(jié)構(gòu)的精細(xì)三維長(zhǎng)時(shí)程觀察。分辨熒光顯微鏡根據(jù)成像原理分為基于頻譜調(diào)制、光激活、抑制點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)邊緣、熒光漲落原理等類型。

二、光片顯微鏡與分辨技術(shù)結(jié)合的成果

1、選擇性照明結(jié)合結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡

2014年，Chen等提出晶格光片熒光顯微（LLSFM）技術(shù)，將結(jié)構(gòu)光照明與光片顯微成像技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了150nm分辨率成像，但光晶格無法多角度旋轉(zhuǎn)，只能在橫平面一個(gè)方向?qū)崿F(xiàn)分辨。2017年，Chang等提出相干結(jié)構(gòu)照明光片熒光顯微技術(shù)（csiLSFM），通過改變光束傳播方向旋轉(zhuǎn)條紋結(jié)構(gòu)光光場(chǎng)，在橫平面各方向?qū)崿F(xiàn)分辨，將空間分辨率提高到100nm，但結(jié)構(gòu)光照明提高分辨率倍數(shù)有限。

2、選擇性照明結(jié)合單分子定位顯微鏡

2011年，Zanacchi等首次將單分子定位分辨技術(shù)引入光片熒光顯微成像，提高了圖像信噪比，在厚散射樣本中實(shí)現(xiàn)單分子納米級(jí)定位和三維活細(xì)胞分辨成像，分辨率達(dá)60nm。2019 年，Kim等提出單分子斜平面分辨顯微鏡（obSTORM），擴(kuò)大了單分子定位系統(tǒng)軸向范圍，展示了多種樣本深度達(dá)66μm 的分辨率成像。

3、選擇性照明結(jié)合STED顯微鏡

2011年，F(xiàn)riedrich等將選擇平面顯微技術(shù)與STED相結(jié)合，發(fā)揮了STED成像速度快和光片顯微成像深度深、光強(qiáng)低的優(yōu)點(diǎn)，提高了軸向分辨率，實(shí)現(xiàn)對(duì)厚活體生物快速高分辨成像，打破了STED只能用于組織表面成像的限制。

4、選擇性照明結(jié)合計(jì)算分辨成像

2016年，Chen等提出雙光子分辨率光片成像（2PLS-SOFI），基于波動(dòng)/閃爍探針的非線性激勵(lì)開發(fā)了相關(guān)顯微鏡，提高了空間和時(shí)間分辨率。2020年，Chen等改進(jìn)貝葉斯分辨技術(shù)，提高了數(shù)據(jù)處理速度。2022年，Zhao等提出漸進(jìn)式深度學(xué)分辨率策略與雙環(huán)調(diào)制選擇性平面照明顯微鏡設(shè)計(jì)結(jié)合，以100nm各向同性空間分辨率可視化活細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)數(shù)小時(shí)，揭示了細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)關(guān)系和相互作用。

光片顯微鏡在分辨成像中的應(yīng)用

光片顯微鏡在易用性方面的發(fā)展

一、早期結(jié)構(gòu)限制

早期光片成像系統(tǒng)照明與探測(cè)光路垂直，雙物鏡限制了樣本類型和應(yīng)用。在許多應(yīng)用中，傳統(tǒng)光片系統(tǒng)因樣本夾持或生物體結(jié)構(gòu)遮擋無法從正交方向成像，且在微流控芯片、玻片和96孔板中樣本大規(guī)模成像受限。對(duì)于高倍率成像，物鏡工作距離短，傳統(tǒng)樣本承載方式難以實(shí)現(xiàn)成像，且樣本數(shù)量規(guī)模難以提升。

光片顯微鏡的典型模態(tài)

二、改進(jìn)措施及成果

1、斜置開頂式光片技術(shù)

2015年，Huang等使用特定物鏡組合與傾斜玻片構(gòu)成樣品腔，補(bǔ)償像差，實(shí)現(xiàn)了對(duì)微流控通道和96孔板中多種生物樣本的高通量成像。Jonathan課題組對(duì)倒置開頂式光片系統(tǒng)進(jìn)行一系列技術(shù)改進(jìn)，包括設(shè)計(jì)SIL拓展應(yīng)用、用SIMlens代替SIL校正像差、提出緊湊型可變分辨率倒置開頂式顯微鏡并證明其實(shí)用性。

2、單物鏡光片顯微成像技術(shù)

2008年，Dunsby提出斜平面顯微鏡（OPM），采用離軸激發(fā)和遠(yuǎn)程聚焦技術(shù)，單物鏡負(fù)責(zé)光片激發(fā)和熒光信號(hào)采集。2015年，Bouchard等提出掃描、共焦對(duì)齊平面激發(fā)（SCAPE）顯微鏡，實(shí)現(xiàn)多類樣本快速、溫和、高分辨率三維活體成像，但遠(yuǎn)程成像模塊導(dǎo)致成像性能損失。2019年，Yang等將遠(yuǎn)程聚焦物鏡換為水鏡提升收光能力，2022年，Yang等提出DaXi技術(shù)，使用定制高質(zhì)量高數(shù)值孔徑遠(yuǎn)程聚焦物鏡，實(shí)現(xiàn)幾乎不損失分辨率的三維高速成像。然而，單物鏡光片顯微鏡存在數(shù)值孔徑、像差、倍率切換等問題，目前更適用于單一高倍率系統(tǒng)。

結(jié)與展望

單物鏡光片顯微鏡雖在兼容性上有所拓展，但仍存在不少缺陷。大視野成像時(shí)，受技術(shù)原理與結(jié)構(gòu)限制，面臨諸多難題，如光線傳播與光場(chǎng)分布不均，致使難以獲取大視野清晰圖像。其像差校正極為復(fù)雜，照明與探測(cè)光路斜交產(chǎn)生像差，現(xiàn)用三物鏡遠(yuǎn)程聚焦法雖能校正，但系統(tǒng)復(fù)雜、成本高、穩(wěn)定性低且易受環(huán)境影響，對(duì)*人員依賴度高。倍率切換也困難重重，遠(yuǎn)程聚焦使探測(cè)光路復(fù)雜，物鏡光學(xué)參數(shù)受限，無法像共聚焦顯微鏡那樣原位自由變倍，嚴(yán)重影響研究效率。因此，目前在中低倍情況下分辨率較差，無法滿足多種研究需求。

展望未來，期待*直接探測(cè)光片顯微成像系統(tǒng)。它要大幅提升探測(cè)分辨率，*呈現(xiàn)樣本細(xì)節(jié)；提高熒光收集效率，增強(qiáng)成像靈敏度與對(duì)比度；解決倍率切換問題，實(shí)現(xiàn)便捷原位變倍，兼具良好成像性能；達(dá)成對(duì)多種樣本高通量、高分辨、智能化三維成像分析，涵蓋單細(xì)胞到大型組織。若能實(shí)現(xiàn)，光片顯微鏡將融合高性能、通用性與易用性，成為下一代熒光顯微成像關(guān)鍵技術(shù)，有力推動(dòng)多領(lǐng)域發(fā)展。

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來源于：周瑤, 費(fèi)鵬. 光片熒光顯微成像技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用（特邀）[J]. 激光與光電子學(xué)進(jìn)展, 2024, 61(6): 0618019. Yao Zhou, Peng Fei. Development and Application of Light Sheet Fluorescence Microscopy Technology (Invited)[J]. Laser & Optoelectronics Progress, 2024, 61(6): 0618019.

高通量單分子定位顯微成像技術(shù)進(jìn)展

全新費(fèi)斯托FESTO氣缸DSBC...